(资料图片仅供参考)

分离模式

液相色谱柱种类繁多，在精准选择液相色谱柱之前，首先必须选择HPLC的分离模式，根据使用的固定相和流动相的组合不同，可以得到下列各种各样的分离模式。

了解样品

了解待检样品的结构、分子量、溶解性、离子化、极性、pH值等物理化学性质，再参照下图选择适合的分离模式和精准的液相色谱柱固定相：

色谱柱参数

色谱柱性能影响因素有很多，例如，硅胶纯度、色谱柱尺寸、颗粒形状、粒径、表面积、孔径，化学性质包括键合类型、碳覆盖率、封端，下面依次介绍各参数对色谱柱性能的影响，并根据以上参数精准地选择液相色谱柱。 1、硅胶纯度硅胶纯度对强极性化合物的分离最为重要，残留金属离子浓度、硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，易发生拖尾。 2、色谱柱尺寸增加色谱柱长度，可以在一定程度上提高柱效，但也会升高压力和导致峰展宽；含量测定、溶出检测等对于分离的要求较低，可选用较短的色谱柱，减少运行时间。内径大，提高载样量，但也会增加横向扩散，同样会导致峰展宽。内径小的色谱柱灵敏度较高，峰型更窄，但是载样量较小。如果载样量满足要求，需要更高更尖锐的峰提高灵敏度，可以选择更小内径，但压力较大，对系统要求较高。 短柱（15-100mm）运行时间短、柱压低；长柱（150-250mm）分辨率高、运行时间长；小内径（≤2.1mm）检测器灵敏度高；大内径（3-21.2mm）载样量高、耐污染、寿命长。3、颗粒形状粒径球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；当使用粘度较大流动相时，球形颗粒可降低柱压，延长色谱柱寿命。 常见的两种填料颗粒类型：

全多孔硅胶型

表面多孔/核壳型

相同键合基团键合技术选择性相同；全多孔填料更为常见，键合相种类更多；核壳型填料可以在较大的粒径下得到更高柱效，从而降低使用压力。 4、粒径粒径指柱填料颗粒直径的大小，实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值，通常1.5-10μm。粒径小的色谱柱分离度较好，但色谱柱压力更大，如果5μm粒径的色谱柱分离度稍有不足，则同型号3μm色谱柱的分离度一般会提供令人满意的选择性。 5、表面积表面积是指颗粒外表面与内部孔面积的总和，以m²/g表示，高表面积对于多组分样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度；表面积低的柱填料能迅速达到平衡状态，对于梯度洗脱尤为重要。 6、孔径孔径是指填料颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是120～300Å，多孔色谱填料与目标物的作用绝大部分（＞95%）是发生在填料颗粒的内部，即孔内的，所以孔对于色谱填料也是最重要的参数之一，一款填料孔径大小(Pore Size)和孔径分布(Pore Size Distribution)，在绝大多数的色谱分离纯化中，起到关键性作用。 大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，达到充分分离，改善峰形，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子；较小孔径提供较高的表面积，可用于较大的载荷量，并保留小的有机化合物，可用于小分子有机物到聚合物的分离。 孔径和粒径的关系：样品分子直径小于平均孔径才能进入微粒内部，所选色谱柱孔径至少是样品流体学直径的4倍，一般根据样品的分子量选择适合的孔径。 分子量＜2000， 选择孔径80～180Å分子量＞2000，选择孔径300Å，300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽。7、不同的载碳量载碳量越高，固定相传质效应增加，高载碳量，有利于不易保留化合物的分离，水解稳定性好，重现性好；低载碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶剂损耗、减少运行时间。 8、封端硅胶键合相填料中有部分未封端的残留硅羟基，封端可以减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应，改善保留和峰形，这对于碱性化合物尤其重要。而不同的封端技术也会直接影响色谱柱的效能。小析姐在后续也会继续分享液相色谱中关于流动相（种类、比例、模式）和仪器参数（分离模块、检测模块）的相关知识，想了解更多关于色谱柱使用的知识，可以关注我们公众号哦 ！